Глоссарий по редактированию генома

Метод, подразумевающий ввод в ткани растения (главным образом листья) плазмидосодержащей суспензии с культурой Agrobacterium tumefaciens с целью вызвать высокую кратковременную экспрессию Т-ДНК.

Ген растения родственного вида.

Произвольное введение цисгена в редактируемый участок генома растения.

Замена или добавление (исходя из набора естественным образом наличествующих/отсутствующих генов) цисгена/аллеля в изначальном участке генома.

Адаптивная иммунная система бактерий и архей, применяемая в целях редактирования генома. Термином CRISPR описывается отрезок генома растения-хозяина, содержащий повторяющиеся последовательности и специальный сегмент вирусной ДНК, называемый спейсером. Ассоциированные с CRISPR белки используют эти последовательности для локализации генов и защиты клетки путем идентификации и уничтожения вирусной ДНК.

Белок (эндонуклеаза) в составе иммунной системы CRISPR у бактерий, используемый для редактирования генома. Белок Cpf1 использует молекулу РНК для локализации и расщепления комплементарной ДНК (гидовой РНК), в результате чего образуется двухцепочечный разрыв. В сравнении с Cas9, у Cpf1 немного иная последовательность протоспейсер-ассоциированного мотива (ПАМ) и другой принцип расщепления ДНК.

Белок (эндонуклеаза) в составе иммунной системы CRISPR у бактерий, используемый для редактирования генома. Белок Cas9 использует молекулу РНК для локализации и расщепления комплементарной ДНК (гидовой РНК), в результате чего образуется двухцепочечный разрыв. Работа иммунной системы CRISPR построена на разрушении вирусной ДНК с целью не допустить инфицирование клеток хозяина.

Белок (эндонуклеаза), ассоциированный с ДНК-связывающими доменами «цинковых пальцев» или нуклеазами эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALEN). FokI разрезает только одну цепочку ДНК (одноцепочечный разрыв), поэтому для внесения двухцепочечных разрывов требуется пара «цинковых пальцев» или нуклеаз TALEN. Домены, где белком FokI был выполнен разрез ДНК, сплавлены с инактивированным белком Cas9 (или dCas9, где d значит «дефицитный»), в связи с чем для внесения двухцепочечного разрыва также требуется наличие димера.

Данный термин является общим для целого ряда новых методик, каждая из которых имеет свои особенности. Они состоят в создании двухцепочечных разрывов в строго определенных точках последовательности ДНК. Ввиду неточности механизма репарации ДНК (негомологичного соединения концов) двухцепочечные разрывы могут приводить к возникновению мутаций (InDel, SNP). При наличии модели репарации (известной как матрица) для внесения определенных изменений в ДНК или вставки целых генов может быть применен механизм гомологичной рекомбинации, отличающийся точностью. В число методов, описываемых данным термином, входит применение CRISPR/CAs, TALEN, «цинковых пальцев», мегaнуклеаз, а также направленный мутагенез.

Короткие сегменты РНК, которые направляют ДНК-расщепляющие ферменты (эндонуклеазы) к целевому участку генома. гРНК содержат участок, соответствующий целевой последовательности (обычно 20 нуклеотидов), а также сегмент, взаимодействующий с эндонуклеазой (например, Cas9).

Клеточный механизм репарации цепочек ДНК, который состоит из сегмента гомологичной донорской ДНК (служащей в качестве матрицы репарации), "штопающего" разрывы ДНК. Чтобы донорскую ДНК можно было вставить в геном, ее последовательность должна быть достаточно схожей с участком, подлежащим расщеплению нуклеазами. ГР отличается большей точностью репарации, чем негомологичное соединение концов (NHEJ). При редактировании генома конструирование и вставка донорской ДНК происходит с максимальной точностью, что потенциально позволяет заменить дефективный ген его здоровой копией.

Сокращение, обозначающее инсерционно-делеционный полиморфизм, т.е. произвольное удаление или ввод нуклеотидов в последовательность ДНК. Мутации InDel возникают вследствие неточной репарации двухцепочечных разрывов при NHEJ. Зачастую это приводит к преждевременной вставке стоп-кодонов и, как следствие, прекращению формирования генетической цепочки.

Любая новая комбинация генов и регуляторных элементов, которые принадлежат одному виду или близкородственным видам растений, рекомбинируются вне организма и вводятся в геном растения, от которого они могут быть генетически унаследованы.

Процесс, ведущий к возникновению мутаций в последовательности ДНК.

Изменение в последовательности ДНК организма. Такие изменения могут быть незначительными (SNP, малые мутации InDel), включать тысячи пар нуклеотидов (инсерции, делеции, транслокации, замещения), либо целые хромосомы.

Общий термин для новых методов селекции растений, позволяющих внести точные генетические изменения и повысить генетическое разнообразие растений. Благодаря своей точности и эффективности они стоят особняком от традиционных методов селекции, таких как скрещивание, отбор и традиционный мутагенез посредством химического или радиационного воздействия. Значение данного термина включает в себя агрофильтрацию, цисгенез, CRISPR/Cas, прививку, направленный мутагенез, РНК-зависимое метилирование ДНК, обратную селекцию, применение нуклеаз TALEN и «цинковых пальцев».

Клеточный механизм репарации ДНК, основанный на соединении свободных концов, появившихся в результате разрыва цепочки ДНК. Данный механизм менее точен по сравнению с гомологичной рекомбинацией и часто приводит к произвольному вводу или удалению нуклеотидов на участке разрыва, что является причиной инсерций и делеций в генетическом коде.

Прямое или косвенное, незапланированное, кратко- или долгосрочное последствие воздействия на организм, не соответствующее изначальной цели (например, когда применяемая для редактирования генома нуклеаза расщепляет произвольный, нецелевой участок ДНК, похожий на целевой).

Метод редактирования генома, при котором совершается единичный нуклеотидный обмен в геноме растения с помощью олигонуклеотида, обычно включающего в себя 20-100 нуклеотидов, комплементарного целевой последовательности ДНК в геноме растения за исключением изменяемой пары нуклеотидов.

Данный термин описывает такие инновационные технологии, как секвенирование генома, «омики» и методы увеличения генетического разнообразия. Данные технологии позволяют узнать больше о генетике и физиологии растений, а также принципах взаимодействия растений и патогенов. Описываемые данным термином методы помогают селекционерам выявлять и изучать селекционно-значимые характеристики, а также выполнять селекционные задачи быстрее и более качественно.

Короткая цепочка нуклеотидов, которая должна непосредственно прилегать к целевой последовательности ДНК, чтобы белок Cas9 или Cpf1 мог их связать и расщепить. Отсутствие ПАМ в геноме хозяина не позволяет CRISPR совершить расщепление участка ДНК.

Нуклеиновая кислота, полученная путем объединения вне организма двух и более молекул нуклеиновых кислот, которые после переноса в организм могут генетически наследоваться (см. BVL, 2017; EFSA, 2015; NIH, 2016).

Подавление рекомбинации с помощью ввода трансгена (на основе РНК-интерференции) с целью получения полностью гомозиготных удвоенных гаплоидов для создания гибридов. Получаемые в итоге растения не несут в себе данный трансген.

Подавление экспрессии (например, при транскрипционном сайленсинге) целевых генов через метилирование промоторной последовательности. Чтобы инициировать процесс RdDM, в клетку с помощью действующих на основе РНК-интерференции конструкций вводятся последовательности, обеспечивающие гомологичную вставку РНК на нужном участке промотора.

Методы, при которых полученные изменения происходят из произвольных мутаций (делеций, инсерций или SNP), спровоцированных неточным механизмом репарации ДНК (NHEJ).

В случае с SDN-2 в клетку вносится модель (матрица) репарации, которая с помощью точного механизма гомологичной рекомбинации приводит к получению точечных изменений.

В случае с SDN-3 для вставки или обмена генов и/или регуляторных элементов (например, вариантов аллелей) используется репарация двухцепочечных разрывов ДНК посредством гомологичной рекомбинации с вводом молекулы ДНК в качестве матрицы.

Обмен единичного нуклеотида в последовательности ДНК.

Методы, при которых двухцепочечные разрывы производятся в строго определенных точках генома посредством эндонуклеазы. В качестве ДНК-связывающего участка может использоваться белок или РНК. Данный термин описывает методы CRISPR/CAs, TALEN, а также метод «цинковых пальцев» (ZNF). Методы SDN делятся на SDN-1, SDN-2 и SDN-3 в зависимости от масштаба вызванных изменений.

Метод редактирования генома, при котором один участок белка распознает конкретную последовательность ДНК, а другой его участок разрезает данную последовательность. Нуклеазы TALEN состоят из цепочки небольших ДНК-связывающих доменов, способных распознавать более длинные последовательности ДНК. Каждый ДНК-связывающий участок TALEN сплавлен с нуклеазой Fokl, которая расщепляет ДНК.

Стабильная интеграция ДНК неродственных видов в геном растения.

Метод редактирования генома, при котором один участок белка распознает конкретную последовательность ДНК, а другой его участок разрезает данную последовательность. Нуклеазы ZNF состоят из цепочки небольших ДНК-связывающих доменов, способных распознавать более длинные последовательности ДНК. Каждый ДНК-связывающий участок ZNF сплавлен с нуклеазой, расщепляющей ДНК.